Ochronne działanie filtratu wydzieliny ślimaka przeciwko wywołanemu etanolem wrzodowi żołądka

Abstrakt

Wrzód żołądka lub wrzód trawienny jest powszechną chorobą na całym świecie. Zasadniczo rozwija się, gdy występuje brak równowagi między czynnikami ochronnymi i agresywnymi, szczególnie na powierzchni świetlnej komórek nabłonkowych. W związku z tym istnieje stałe zainteresowanie badaniami nad nowymi lekami do leczenia wrzodów żołądka. Wydzielina ślimaka jest gęstym śluzem, który pokrywa zewnętrzną powierzchnię ślimaków, z ważnymi funkcjami dla przetrwania ślimaków. Biologiczne właściwości śluzu ślimaka Helix, Aspersa, Muller, od wieków wiadomo, że leczy ludzkie zaburzenia, w szczególności choroby skóry. Ostatnio stosowanie śluzu ślimaka wzrosło na całym świecie, jako składnik produktu kosmetycznego i było stosowane w szczególności w leczeniu ran i chorób skóry. W tym badaniu używamy mysiego modelu podawania etanolu dożołądkowego, który był szeroko stosowany do testowania skuteczności leków i badania mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju wrzodów żołądka. Dożołądkowe podawanie etanolu powoduje kilka uszkodzeń błony śluzowej i indukcję ciężkiej odpowiedzi zapalnej. Nasze wyniki wykazują znaczący efekt ochronny filtratu wydzielania ślimaka w zmniejszaniu zmian makroskopowych i histologicznych, a także działanie ochronne na zawartość śluzu, stres oksydacyjny i odpowiedź zapalną. Podsumowując, badanie to pokazuje ochronne działanie wewnątrzżołądkowego filtratu wydzielania ślimaka, w modelu wywołanego etanolem wrzodu żołądka u myszy, co sugeruje jego możliwe użyteczne zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu wrzodom żołądka.

Wprowadzenie

Wrzód żołądka lub wrzód trawienny jest chorobą, która dotyka znaczną liczbę ludzi na całym świecie. Zasadniczo rozwija się, gdy występuje brak równowagi między czynnikami ochronnymi i agresywnymi na powierzchni świetlnej komórek nabłonkowych. Najczęstszymi czynnikami przyczyniającymi się do rozwoju choroby wrzodowej żołądka są zakażenie Helicobacter pylori, długotrwałe stosowanie aspiryny lub innych NLPZ oraz inne czynniki, takie jak picie alkoholu, palenie tytoniu i nawyki żywieniowe^1,2,3. Przyczyny wymienione powyżej powodują brak równowagi w normalnej barierze błony śluzowej. W rzeczywistości zwykle na powierzchni świetlnej żołądka znajduje się warstwa przylegającego śluzu. Ponadto śluz żołądkowy działa jako warstwa ochronna dla leżącego poniżej nabłonka, z soku żołądkowego i pepsyny. Zawartość śluzu żołądkowego jest zwykle równoważona przez wydzielanie nowego śluzu w celu utrzymania ciągłej bariery, przeciwko ciągłemu działaniu soku żołądkowego i pepsyny⁴. W leczeniu wrzodów żołądka dostępnych jest kilka leków, wspólne podejście opiera się na stosowaniu antagonizmu receptora H i inhibitorów pompy protonowej lub stosowaniu leków o mechanicznym działaniu ochronnym na błonę śluzową żołądka⁵. Jednak długotrwałe stosowanie tych leków może powodować poważne działania niepożądane⁶. Tak więc istnieje stałe zainteresowanie badaniami nad nowymi lekami do leczenia wrzodów żołądka, ze szczególnym zainteresowaniem substancjami pochodzenia naturalnego. Wydzielina ślimaka lub śluz jest gęstym śluzem, który pokrywa zewnętrzną powierzchnię ślimaka. Ten śluz jest wytwarzany przez szczególnie ślinowe gruczoły naskórkowe w ślimaku. Śluz ma różne funkcje dla życia ślimaków z jego właściwościami klejowymi, zmiękczającymi, ochronnymi i naprawczymi⁷. Śluz Helix Aspersa Muller, wciąż nie jest dobrze scharakteryzowany skład⁷. W rzeczywistości substancje bioaktywne obecne w tym osobliwym produkcie naturalnym sprawiają, że jest to wyjątkowy produkt, którego nie można odtworzyć w laboratorium i ze związkami syntetycznymi. Biologiczne właściwości śluzu ślimaka Helix Aspersa Muller, od wieków wiadomo, że leczy zaburzenia u ludzi, w szczególności w przypadku chorób skóry. Ostatnio stosowanie śluzu ślimaka wzrosło na całym świecie, jako składnik produktu kosmetycznego i było stosowane w szczególności do leczenia ran i leczenia przewlekłego zapalenia oskrzeli^8,9. Zaobserwowano, że składniki śluzu ślimaka są w stanie stymulować tworzenie składników skóry, w szczególności tworzenie kolagenu i elastyny, oraz minimalizować szkody generowane przez stres oksydacyjny i wolne rodniki¹⁰. Wykazano, że posiada również inne ważne właściwości biologiczne, takie jak działanie przeciwdrobnoustrojowe i działanie ochronne w gojeniu się ran¹¹. W rzeczywistości wykazano skuteczność ekstraktu Helix Aspersa jako bezpiecznego i skutecznego alternatywnego leczenia w leczeniu ran otwartych oparzeń częściowej grubości u dorosłych, sprzyjając jego ponownej epitelizacji⁹. Te ważne właściwości śluzu ślimaka, a w szczególności pro-epitelizacja i naprawa ran, wynikają ze szczególnego składu chemicznego tego związku¹². Ponadto wiele składników obecnych w śluzie ślimaka odgrywa zasadniczą rolę w homeostazie i ochronie błony śluzowej żołądka. W szczególności wykazano już działanie ochronne w błonie śluzowej żołądka dla niektórych składników najbardziej obecnych w filtracie wydzielania ślimaka (SSF), takich jak kolagen, elastyna, kwas glikolowy i alantoina^13,14. Istnieje jednak wiele innych związków obecnych w śluzie ślimaka, które przyczyniają się do jego szczególnego działania ochronnego, takiego jak składnik mineralny¹⁵, na przykład ze względu na obecność miedzi w SSF. W rzeczywistości wykazano, że miedź ma działanie przeciwwrzodowe¹⁶. Wreszcie, również składnik mukopolisacharydowy naturalnie obecny w śluzie ślimaka odgrywa kluczową rolę w działaniu ochronnym na tkanki śluzowe^17,18. Dlatego na podstawie znanych właściwości śluzu ślimaka i patofizjologii wrzodu żołądka, hipoteza tego badania jest taka, że doustne leczenie SSF może być użytecznym narzędziem w utrzymaniu homeostazy błony śluzowej żołądka oraz w zapobieganiu lub leczeniu zapalenia błony śluzowej żołądka, a zatem wrzodu żołądka. Mysi model podawania etanolu dożołądkowego był szeroko stosowany do testowania skuteczności leków i badania mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju wrzodów żołądka, podawanie etanolu dożołądkowego powoduje kilka uszkodzeń błony śluzowej i indukcję ciężkiej odpowiedzi zapalnej^19,20. Alkohol indukuje również znaczny wzrost stresu oksydacyjnego poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i peroksydację lipidów, stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w chorobie wrzodowej żołądka²¹. W tym badaniu po raz pierwszy badamy potencjalnie ochronny wpływ filtratu wydzielania ślimaka w eksperymentalnym modelu wrzodu żołądka wywołanego etanolem u myszy. Ocena wpływu na błonę śluzową żołądka, stres oksydacyjny i odpowiedź zapalną.

Wyniki

Charakterystyka chemiczna filtratu wydzielania ślimaka (SSF)

Rysunek 1 panel a przedstawia jakościowe i ilościowe właściwości i skład EZSN. SSF zastosowany w tym badaniu wykazał wysoką zawartość kwasu glikolowego i kolagenu, a następnie alantoiny i elastyny, jak pokazano w charakterystyce chemicznej pokazanej na ryc. 1 oraz rysunek uzupełniający S1-S8. Dawka SSF zastosowana w tym eksperymentalnym modelu ostrego wrzodu wywołanego etanolem u myszy została obliczona na podstawie maksymalnej objętości w ml/kg, jaką może podać o.s. myszom, tak aby stopniowo uzyskać większą powierzchnię błony śluzowej żołądka w kontakcie z SSF. W szczególności zostały wybrane jako wysoka dawka 15 ml / kg, średnia 7,5 ml / kg i niska 3 ml / kg. Całkowita zawartość białka w SSF wynosiła 25,6 mg/ml. Profile elektroforezy w żelu dodecylowo-poliakryloamidowym (SDS-PAGE) białek SSF z Helix Aspersa Muller przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1.

Ryc. 1

Qualitative and quantitative analysis of crude SSF. Full chemical characterization are shown in supplementary figure S1-S7.

Full size image

Effect of SSF on macroscopic examination

One hours after EtOH gastric ulcer induction, as show in Fig. 2 the stomachs from EtOH group (the negative control group) showed a significant presence in mucosa hyperemia and mucosal damage with large ulcer formation. Instead the treatment with omeprazole (used as positive control) at dose of 20 mg/kg significant prevent the ulceration and mucosal damage induced by EtOH. The treatment with SSF showed a dose dependent protective effect as showed in Fig. 2 by the graphs of gastric ulcer index and the preventive index. In particular the dose of 15 ml/kg and 7.5 ml/kg showed an important reduction in mucosal damage and ulceration compared to EtOH group.

Figure 2

The macroscopic picture of stomach from different experimental groups. stomachs from EtOH group (the negative control group) showed a significant presence in mucosa hyperemia and mucosal damage with large ulcer formation, instead the treatment with omeprazole at dose of 20 mg/kg significant prevent the ulceration and mucosal damage induced by EtOH. The treatment with SSF showed a dose dependent protective effect. Data are presented as means ± SEM, or median with interquartile range for non-parametric data of 10 mice for each group .***p < 0.001 versus control; ◦p < 0.05 versus EtOH; ◦◦◦p < 0.001 versus EtOH; ###p < 0.001 versus omeprazole.

Full size image

Effect of SSF on histological damage

As show in Fig. 3a, compared to stomach tissue from control group the EtOH group showed a significant increase in tissue damaged characterized by a significant epithelial cell loss, edema, hemorrhagic damage and abundant presence of inflammatory cells . The treatment with SSF showed a dose dependent protective effect in particular with a significant protective effect on epithelial cell loss. Lower magnification of histological images on both upper and lower mucosa are shown in supplementary figure S8-S13. The presence of inflammatory cells has been confirmed thought MPO assay that showed a significant increase in MPO in EtOH group compared to control group. As show in Fig. 3b, the treatment with omeprazole significant prevent the increase in MPO, for the SSF treatment only the dose of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect on increase in MPO induced by EtOH.

Figure 3

Stomach tissue section from: Control group healthy mice; EtOH group negative control; omeprazole 20 mg/kg positive control group; Histological section was assessed for: a) epithelial cell loss; b) edema in the upper mucosa; c) hemorrhagic damage; d) presence of inflammatory cells. The treatment with SSF showed a dose dependent protective effect SSF 3 ml/kg by os; SSF 7.5 ml/kg by os; SSF 15 ml/kg by os. Panel b showed the resuts of MPO assay. Data are presented as means ± SEM, or median with interquartile range for non-parametric data of 10 mice for each group.***p < 0.001 versus control; ◦p < 0.05 versus EtOH; ◦◦p < 0.01 versus EtOH; ◦◦◦p < 0.001 versus EtOH.

Full size image

Effect of SSF on mucosa glycoproteins and collagen contents

Mucosa glycoprotein evaluation was performed using PAS staining. As show in Fig. 4, one hour after the EtOH administration, in the stomach from mice of EtOH group there was a significant decrease in PAS staining compared to sham group. The loss in mucosa glycoprotein was significantly reduced by pre-treatment with omeprazole. Compared to EtOH group the treatment with SSF at dose of 3 ml/Kg did not show any notable protective effect, instead the dose of 7.5 and 15 ml/kg of SSF showed a significant protective effect in a dose dependent manner compared to the EtOH group. Through Masson staining collagen can be dyed in blue, by which we can roughly evaluate the healing effect at the macro level and stains also showed the formation of granulation tissue ad collagen disorganization in the gastric wall. As show in Fig. 5, in the EtOH group stain indicated fragmented and disorganized collagen fibers, while omeprazole group showed a significative protective effect. For the SSF treatment only the dose of 15 ml/Kg showed a significant protective effect.

Figure 4

PAS staining from control group showed the normal contents of mucosa glycoprotein(magenta color); EtOH group showed a significantly reduction in PAS staining, significantly inhibited by treatment wit omeprazole 20 mg/Kg; SSF treatment showed a dose dependent protective effect as showed by the increase of PAS staining. Image J software (1.49v, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997–2018. Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W.) was used for the quantification of glycoprotein as the positively stained area (pixel/field). Data are presented as means ± SEM of 10 mice for each group.***p < 0.001 versus control; ◦◦◦p < 0.001 versus EtOH.

Full size image

Figure 5

Representative image of collagen within mucosa layer using Masson’s trichrome staining. Control group showed the staining in healthy gastric tissue. EtOH group stain indicated fragmented and disorganized collagen fibers, while omeprazole group showed a significative protective effect. For the SSF treatment only the dose of 15 ml/Kg showed a significant protective effect.

Full size image

Effect of SSF on mucus contents and oxidative stress

The mucus contents assay was performed by alcian blue binding assay. As showed by the graph in Fig. 6a, the mucus contents was significantly reduced in the EtOH group compared to the control group. When compared to EtOH group, the omeprazole group showed a significant decrease in mucus contents loss, the treatment with SSF showed a dose dependent protective effect on mucus contents loss due to EtOH administration. To assess the effect of on SSF on oxidative stress we evaluated the levels of MDA as index of lipid peroxidation, as show in Fig. 6b intragastrical EtOH administration induced a significant increase MDA levels, while the treatment with omeprazole prevent this increase in MDA in a significant manner, the treatment with SSF showed a dose dependent protective effect on mucus. Next we observed a significant reduction in CAT and SOD induced by EtOH administration that has been significantly antagonized by omeprazole pre-treatment. As show in Fig. 6c,d treatment with SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner.

Figure 6

(a) The graph showed the mucus contents evaluation performed by alcian blue binding assay. (b) MDA assay levels. (c, d) CAT and SOD determination. Data are presented as means ± SEM of 10 mice for each group; .***p < 0.001 versus control; ◦◦p < 0.01 versus EtOH; ◦◦◦p < 0.001 versus EtOH;

Full size image

Effect of SSF on PGE₂ and inflammatory response

As show in Fig. 7a, through ELISA assay we evaluated the levels PGE₂ in gastric tissue homogenates, compared to control group EtOH administration induced a significant decrease in PGE_2, significantly antagonized by omeprazole pre-treatment. The treatment with SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner. Figure 7b–d, showed the results for the ELISA assays for mayor pro inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α, respectively. EtOH administration induced a significant increase in IL-6, IL-1β, TNF-α levels significantly antagonized by omeprazole pre-treatment. The treatment SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner.

Figure 7

ELISA assays for (a) PEG₂; (b) IL-6; (c) IL-1β; (d) TNF-α . Data are presented as means ± SEM of 10 mice for each group; ***p < 0.001 versus control; ◦◦p < 0.01 versus EtOH; ◦◦◦p < 0.001 versus EtOH;

Full size image

Discussion

Several factors contributes to gastric ulcer development, such as drug abuse, alcoholism, endocrine dyscrasia and bacterial helicobacter pylori infection, which can cause mucosal barrier damage through alteration in gastric acid secretion and characterized by hemorrhage and severe inflammatory response^22,23. A key event in gastric ulcer formation is the imbalance in the gastric mucosa between the defensive factor such as mucin, prostaglandin, bicarbonate nitric oxide and growth factor, and the offensive factor such as increased secretion of pepsin and gastric acid. Thus inflammatory response, oxidative stress, and neutrophilic infiltration has been show a key role in pathophysiology of gastric ulcer, on the other hand endogenous antioxidant, mucus layer acts as protective agents^24,25. The common approach in treating the gastric ulcer is based on H receptor antagonism and proton pump inhibitors⁵. These class of drugs may cause serious adverse effect when used for prolonged time⁶. Recently, several studies has highlighted the ability of snail secretion (or snail mucus), to improve skin conditions thanks to its peculiar proprieties such as emollient, moisturizing, lubricating and protective, especially to prevent skin damage, and thus there is a growing interest in the use of this compound in cosmetology²⁶. Furthermore the Helix Aspersa Muller secretion has shown to possess other important biological properties such as, antimicrobial activity¹¹ and wound repair²⁷. Several studies have highlighted the absence of cytotoxic effects in different cell lines such as in human keratinocytes, human dermal fibroblasts (MRC-5) and murine embryo fibroblasts (NIH-3T3)^12,27. These effect of Snail mucus is due also to his peculiar mechanical proprieties due mucopolysaccharide contents, on the other hand these effects are due to the peculiar contents of active molecules¹². As previously demonstrated, the two molecules the glycolic acid and allantoin, most present in snail slime were believed to be an essential component for the biological activities of snail slime⁹, however recently has been demonstrated that the mucus in toto has a greater effect than that of the individual molecules²⁷. Thus, a synergism in activity of several molecules present in snail secretion cannot be excluded, factor that make a snail secretion a peculiar compound with important biological proprieties. In fact, beyond all molecules contained in snail secretion also the specific ratio of these components in the natural snail secretion is a key factor for the biological activity. So, in this study we consider the crude Snail Secretion Filtrate (SSF) form Helix Aspersa Muller as compound “in toto” and it is not possible to understand which one the molecule is responsible for the biological activity. In this study due to the route of administration and the maximum volume in ml/kg that can be given by o.s. in mice²⁸, we consider three dose of SSF as high dose of 15 ml/kg, medium of 7.5 ml/kg and low 3 ml/kg, to gradually obtain a greater surface of gastric mucosa in contact with SSF²¹. Considering the proteins content in the SSF the respective dosage as mg/kg were respectively 384 mg/kg, 192 mg/kg and 76,8 mg/kg. We choose an experimental model of ethanol intragastric administration in mice, that has been widely used to explore the underlying mechanism for gastric ulcer development and thus to test the efficacy of new drugs. The intragastric administration of ethanol cause several mucosa damage and an induction of a severe inflammatory response and oxidative stress^19,20,21. In our study, the results of macroscopic gastric evaluation after EtOH administration showed significant protective effect of SSF on gastric mucosa. In particular, the treatment SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner. Also, on histological evaluation of gastric mucosa we confirmed the protective effect of SSF, in agreement with macroscopic score. A fundamental step in involved in the complex event of gastric ulcer formation is the infiltration of neutrophil, in particular activated neutrophil are responsible for increase in oxidative stress and inflammatory response^29,30. Our results on MPO evaluation as index of inflammatory cell infiltration, showed that doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner on neutrophil infiltration. A standard goal in treating gastric ulcer is preventing the decrease or degradation of gastric mucus, that act as a natural protective agent on gastric mucosa³¹. Gastric mucus consist of mucin type glycoproteins and the depletion in gastric wall mucus it has been seen to be closely related to the gastric ulcer pathology^32,33. EtOH induced gastric ulcer is also responsible for the reduction of collagen within gastric tissue³⁴. Therefore, we evaluated both the presence of glycoproteins (PAS staining) and collagen (Masson staining) following the administration of EtOH, and our results show that this has produced a significant reduction in both cases, while the treatment with SSF at doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect. These results are also confirmed by the results of mucus content performed by Alcian blue staining. According to the results mentioned so far we have found that the treatment with SSF at doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect on oxidative stress induced by EtOH, and in particular SSF treatment significantly prevent the increase in MDA levels, and the depletion in CAT and SOD levels. Oxidative stress in related to both initial stage of gastric ulcer development and with the worsening of the pathology³⁵. Has previously demonstrated the gastric mucosa homeostasis is regulated by both the control of oxidative stress status and by secretion of several mediators such as cytokines and prostaglandin. In particular, prostaglandin play a key role on the state of health of the mucosa by regulating several factors such as the stimulation of mucus and bicarbonate secretion, maintaining the integrity of epithelial cells and improving mucosal mucosal blood flow, in particular PGE₂ showed an important role in regulation of these function, an thus PGE₂ act as a gastro protective agent^36,37. Gastric ulcer and an gastric ulcer healing has been seen previously are regulated by the levels of prostaglandin an PGE₂ in particular³⁸. Our results indicate that gastric ulcer induced by EtOH is related with a significantly reduction on PGE₂ levels, the treatment SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner. Inflammatory response is responsible for the progressive trigger and worsening of the gastric ulcer³⁹. Then we evaluated the levels of the mayor inflammatory cytokines responsible for driving the inflammatory response in gastric ulcer such as IL-1β, IL-6 and TNF-α⁴⁰. Ours results showed a significant increased levels of these cytokines in EtOH group while the treatment SSF at the dose of 3 ml/kg did not demonstrate a significant protective effect instead the doses of 7.5 ml/kg and 15 ml/kg showed a significant protective effect in a dose dependent manner in reducing the IL-1β, IL-6 and TNF-α levels. In conclusion this study demonstrate for the first time the protective effect of intragastrical snail secretion filtrate, in a model of ethanol-induced gastric ulcer in mice. The gastric cytoprotective action of snail secretion filtrate might be attributed to an increase or preservation of gastric mucus with preservation of mucosal mucopolysaccharides and collagen that which are also reflected in a reduction of oxidative stress and induced inflammatory response. surely future studies are necessary to clarify the mechanism of action of this peculiar compound, however the proven beneficial effects suggest its possible useful use in the treatment or prevention of gastric ulcer.

Methods

Snail secretion filtrate (SSF) collection and sterilization

Helix aspersa muller mucus was kindly provided by Snail S.R.L.S (Messina, Italy). Briefly the breeding is cruelty free. In particular the mucus was obtained mechanically manually by stimulating snails by sterile cotton swab tip. The mucus is filtered in a first step with a coarse filter stabilizing the pH, after this phase the mucus is passed in a filtration train consisting of 3 different filters (10 micron-1micron -0.22-micron, Pall) and then stored at 4 °C. The use of the 0.22 micron filter is necessary to eliminate impurities and endotoxins in order to make the product injectable.

Snail secretion filtrate (SSF) chemical characterization

The crude Snail Secretion Filtrate extract from different batches, was qualitative and quantitative analyzed by professional service for Snail S.R.L.S (Messina, Italy), (Science4Life srl, Messina Italy. and Sialab srl. Avola, Italy) using standard analytical techniques such as IR/UV vis spectrometry and HPLC analysis to evaluate the protein quality and the allantoin and glycolic acid content respectively, and to obtain a qualitative determination of the total protein content and to a Bradford assay (Bio-Rad) to evaluate the protein amount. Elastin and collagen were analyzed as seen previously^41,42.All-trans-retinol, 13-cis-retinol,Vitamnin B12,Vitamin B3 were analyzed according EN 12,823–1:2014, ISO20634:2015 and UNI EN 15,652:2009 respectively. All slime doses in experiments were subsequently calculated on microgram of proteins per milliliter (mg/mL) content.

Animals

CD1 mice (male, 20–30 g; Envigo) were accommodated in a standard location (room 22 °C and 12-h light/dark cycles) with standard rodent chow and water ad libitum. The animals were adapted to these conditions for 1 week. Messina University Review Board for the care of animals approved the research. All animal experiments agree with the new regulations in Italy (D.Lgs 2014/26), EU regulations (EU Directive 2010/63). All experimental were conducted in according to ARRIVE guidelines.

Ethanol-induced acute ulcer

Ethanol-induced acute ulcer in mice were performed as seen previously^21,43.

Briefly the mice were fasted for 24 h and divided into the follow group:

Control (n = 10): mice were treated by oral gavage with distilled water (15 ml/Kg)

EtOH (n = 10): mice were treated by oral gavage with distilled water (15 ml/Kg) 1 h before ethanol-induced acute ulcer

Omeprazole 20 mg/Kg: mice were treated by oral gavage with omeprazole at 20 mg/kg 1 h before ethanol-induced acute ulcer

SSF 3 ml/Kg: mice were treated by oral gavage with Snail Secretion Filtrate (SSF) at 3 ml/kg 1 h before ethanol-induced acute ulcer

SSF 7,5 ml / kg: myszy były leczone doustnym zgłębnikiem filtratem wydzielinowym ślimaka (SSF) w temperaturze 7,5 przed ostrym wrzodem wywołanym etanolem

SSF 15 ml/kg: myszy leczono doustnym zgłębnikiem filtratem wydzielinowym ślimaka (SSF) w dawce 15 ml/kg 1 h przed ostrym wrzodem wywołanym etanolem

Godzinę po podaniu doustnym ostry wrzód wywołano doustnym podaniem EtOH (98% etanolu zawierającego 150 mM HCl) w dawce 5 ml/kg. Myszy kontrolne traktowano równą objętością wody destylowanej zamiast roztworu EtOH. Zwierzęta poddano eutanazji 1 h po leczeniu mieszaniną EtOH, w znieczuleniu wziewnym izofluranem (5% w powietrzu. Baxter) przez zwichnięcie szyjki macicy. W tym badaniu ze względu na drogę podania i maksymalną objętość w ml/kg, która może być podana przez o.s. myszom^21,28, uważamy trzy dawki filtracji wydzieliny ślimaka (SSF) za wysoką dawkę 15 ml / kg, średnią 7,5 ml / kg i niską 3 ml / kg, biorąc pod uwagę zawartość białek w SSF odpowiednia dawka w mg / kg wynosiła odpowiednio 384 mg / kg, 192 mg / kg i 76,8 mg / kg.

Wskaźnik wrzodów żołądka i wskaźnik profilaktyczny

Po poświęceniu zwierząt żołądki zostały szybko usunięte i przemyte 0,9% solą fizjologiczną. Następnie przeprowadzono makroskopowe badanie żołądka w celu wykrycia wszelkich zmian krwotocznych na błonie śluzowej gruczołów. Długość w mm każdej zmiany została zmierzona w celu określenia średniego wskaźnika owrzodzeń (UI)⁴⁴. Długość (mm) i szerokość (mm) każdego pasma została zmierzona za pomocą suwmiarki z noniuszem. Stopień zmian błony śluzowej żołądka oceniano na podstawie zdjęć cyfrowych, a nasilenie zmian błony śluzowej oceniano następująco: brak wrzodu (0 mm), 1–5 wybroczyn (< 1 mm) (1), 6–10 wybroczyn (< 1 mm) (2), > 10 wybroczyn (< 1 mm) (3), mały wrzód liniowy (< 2 mm) (2), średni wrzód liniowy (2–4 mm) (3), i duży wrzód liniowy (> 4 mm) (4). Jeśli szerokość wynosiła > 1 mm, punkty mnożono przez dwa. Indeks GU (UI) został określony przez dodanie sumy wszystkich wyników i podzielony przez liczbę zwierząt. Wskaźnik prewencyjny (PI) wstępnej obróbki przeciwko owrzodzeniu obliczono według następującego równania:

PI=(UIethanol−UIpréced)/UIethanol×100. PI=(UIetanol−UIpretreated)/UIetanol×100.

Analiza histologiczna

W celu oceny histologicznej żołądek utrwalono w 10% (V / V) obojętnym buforowanym roztworze formaliny, a następnie osadzono w parafinie, pokrojono w plasterki na grubość 5 μm, zabarwiono hematoksyliną-eozyną (H&E)⁴⁵. Próbki zostały zbadane pod mikroskopem optycznym (DM5500, Leica) i oceniono zgodnie z tym, co widzieliśmy wcześniej⁴⁶. Sekcję histologiczną oceniano pod kątem utraty komórek nabłonkowych (wynik: 0-3), obrzęku górnej błony śluzowej (wynik: 0-4), uszkodzenia krwotocznego (wynik: 0-4) i obecności komórek zapalnych (wynik: 0-3), uzyskując maksymalny łączny wynik 14. Sekcje zostały ocenione przez doświadczonego patologa, który był ślepy na badanie.

Pomiar glikoprotein błony śluzowej i kolagenu

Aby dokładniej ocenić zmiany błony śluzowej w tkankach żołądka, wykonaliśmy pomiary glikoproteiny błony śluzowej z okresowym barwieniem kwasowo-Schiffa (PAS) zgodnie z instrukcjami producenta (Bio-optica, Włochy). Dodatnie miejsce glikoproteiny pojawi się jako kolor magenta. Oprogramowanie Image J zostało użyte do określenia pozytywnie zabarwionego obszaru (piksel/pole)^47,48. Barwienie trichromem Massona wykonano zgodnie z protokołem producenta (Bio-Optica, Mediolan, Włochy).

Pomiar zawartości śluzu żołądkowego

Test wiązania błękitu alcyjskiego (Sigma-Aldrich) przeprowadzono zgodnie z tym, co widzieliśmy wcześniej⁴⁹. Po usunięciu żołądka niektóre części żołądka zważono i zanurzono w 10 ml 0,02% błękitu alciańskiego i 0,16 M roztworu sacharozy/0,05 M octanu sodu (pH 5,8) i inkubowano w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Ekstrakt wiążący błękit alciański odwirowywano przy 3000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Absorbancję supernatantu zmierzono przy 620 nm na spektrofotometrze. Wolny śluz w żołądku obliczono na podstawie ilości wiązania błękitu Alcian ze śluzem żołądkowym (mg/g tkanki).

Aktywność mieloperoksydazy

Tkanki żołądka zostały homogenizowane i wykryto aktywność MPO^50,51.

Oznaczanie poziomu malondialdehydu (MDA)

Tiobarbituryk. Pomiar substancji kwasowo-reakcyjnych określono jako marker peroksydacji lipidów. Substancje reagujące kwasem tiobarbiturowym obliczono przez porównanie O.D. ze standardową mieszaniną 1,1,3,3-tetrametoksypropanu/99% malondialdehydu bis (dymetyloacetalu)/99% (MDA) (Sigma, Mediolan, Włochy). Absorbancję supernatantu zmierzono spektrofotometrycznie przy 532 nm, jak pokazano wcześniej⁵².

Oznaczanie markerów stresu oksydacyjnego i oznaczenia biochemiczne

Aktywność SOD w tkance żołądka określono za pomocą zestawu do oznaczania dysmutazy ponadtlenkowej (Cayman Chemicals) zgodnie z protokołami producenta. Aktywność CAT w tkance żołądka określono za pomocą zestawu do oznaczania katalazy (Cayman Chemicals) zgodnie z protokołami producenta. Supernatant homogenatu tkanki żołądka poddano pomiarowi poziomu PGE2 za pomocą zestawu ELISA (Cayman chemicals) zgodnie z protokołami producenta. IL-1β, IL-6, TNF-α mierzono za pomocą zestawu ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher) zgodnie z protokołami producenta.

Analiza wzoru białkowego

Przeprowadzono analizę wzorca białkowego w sposób zaobserwowany wcześniej⁵³. Całkowite stężenia białka w ekstraktach oznaczano metodą Bradforda z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako standardem. Następnie przeprowadzono elektroforezę żelową SDS-PAGE na próbkach o wyrównanych stężeniach białka całkowitego. W szczególności 20 μl próbek zmieszano z 20 μl buforu Laemmli z β-merkaptoetanolem (Bio-Rad) i ogrzewaniem (95 °C, 5 min). następnie 40 μl mieszanych próbek i 5 μl markera białkowego (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Bio-Rad) załadowano na żel i rozpuszczono za pomocą systemu elektroforezy Mini-PROTEAN (Bio-Rad). Pasma białkowe, oddzielone na żelu, zostały utrwalone, zabarwione w QC Colloidal Coomassie Stain i odbarwione roztworem zgodnie z procedurą producenta (Bio-Rad).

Analiza statystyczna

Wszystkie wartości są pokazane jako średni ± błąd standardowy średniej (SEM) z N obserwacji (N = 10) lub mediana z przedziałem międzykwartylowym dla danych nieparametrycznych. Dane analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA Kruskala-Wallisa, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna lub jednokierunkowego ANOVA, a następnie testu post hoc Bonferroniego dla wielu porównań. Wartość p mniejsza niż 0,05 została uznana za istotną: *p < 0,05 w porównaniu z kontrolą; ◦p < 0,05 w porównaniu z EtOH; **p < 0,01 w porównaniu z kontrolą; ◦◦p < 0,01 w porównaniu z EtOH; p < 0,001 w porównaniu z kontrolą; ◦◦◦p < 0,001 w porównaniu z EtOH; #p < 0,05 w porównaniu z omeprazolem; ##p < 0,01 versus omeprazol; ###p < 0,001 kontra omeprazol.

Dostępność danych

Wszystkie dane wygenerowane lub przeanalizowane podczas tego badania są zawarte w tym opublikowanym artykule.

Odwołania

Kusters, J. G., van Vliet, A. H. & Kuipers, E. J. Patogeneza zakażenia Helicobacter pylori. Clin. Mikrobiol. Ap 19, 449–490. https://doi.org/10.1128/CMR.00054-05 (2006).

Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

Li, L. F. i wsp. Palenie papierosów i choroby żołądkowo-jelitowe: związek przyczynowy i leżące u jego podstaw mechanizmy molekularne (przegląd). Int. J. Mol. Med. 34, 372–380. https://doi.org/10.3892/ijmm.2014.1786 (2014).

Artykuł CAS PubMed Google Scholar 

Ma, S. H. i wsp. Wpływ picia alkoholu na rozwój raka żołądka w zależności od statusu zakażenia Helicobacter pylori. Br. J. Rak 113, 1381–1388. https://doi.org/10.1038/bjc.2015.333 (2015).

Gugliandolo, E., Cordaro, M., Fusco, R. et al. Protective effect of snail secretion filtrate against ethanol-induced gastric ulcer in mice. Sci Rep 11, 3638 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-83170-8